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酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)瘦肉精
2011-04-07
酶聯(lián)免疫吸附法是目前最佳的檢測(cè)方法。ELISA 檢測(cè)方法有雙抗體夾心法測(cè)抗原、間接法測(cè)抗體、競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗體等。該文是利用酶聯(lián)免疫吸附法中的競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗體,其原理是利用多克隆抗體既能與鹽酸克倫特羅結(jié)合,也能與包被抗原結(jié)合。這些包被抗原被固定在酶標(biāo)板孔壁上,當(dāng)樣品中含有瘦肉精時(shí),它與包被抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗體中有限量的結(jié)合位點(diǎn)。由于每一個(gè)孔中抗體的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)相同,當(dāng)樣品中瘦肉精濃度低時(shí),就有更多抗體的位點(diǎn)與包被抗原結(jié)合,更多的抗體被固定在酶標(biāo)板壁上,就會(huì)與更多的酶標(biāo)二抗結(jié)合,所以結(jié)果就呈現(xiàn)深蘭色。相反,樣品的瘦肉精濃度高,結(jié)果就呈現(xiàn)淺蘭色。加入終止液后,蘭色相應(yīng)變成黃色,然后用酶標(biāo)儀進(jìn)行測(cè)定。利用競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)瘦肉精,具有速度快,靈敏度高的特點(diǎn),適用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè),對(duì)以后瘦肉精檢測(cè)工作的發(fā)展具有指導(dǎo)作用。
1 實(shí)驗(yàn)材料與方法
1.1 原料的準(zhǔn)備
抽取具有一定批量的有代表性的無皮豬肉,剔除雜質(zhì)、脂肪。將精肉用高速搗碎機(jī)搗碎混合均勻,放置冰箱冷凍備用。取搗碎的樣品5g ,加入25mL ,50mmolHCl 振動(dòng)1.5h ,以達(dá)到均質(zhì)。稱取5g均質(zhì)物(相當(dāng)于1g 肝臟或肌肉),加入離心管中,10000r/min 離心15min。取上清液至另一個(gè)離心管中, 加1mol NaOH 300ul , 混合15min。加入4mL ,500mmol KH2PO4 (pH3.0),迅速混勻置于4攝氏度的冰箱內(nèi)保存至少1.5h。10000 r/min 離心15min ,分離上清液。
1.2 試劑
鹽酸克倫特羅—酶聯(lián)免疫試劑盒
1.3 儀器
電熱恒溫水浴鍋、酶標(biāo)儀、離心機(jī)、勻漿機(jī)(HFJ系列內(nèi)切式勻漿機(jī)，廠家：天津恒奧)、微量加樣器。
1.4 方法
1.4.1 洗板 所有試劑回溫至室溫。將濃縮洗滌液用蒸餾水稀釋10 倍。將酶聯(lián)免疫板取出,放在室溫下平衡5min。每孔加入300uL 洗液,放置1min ,再甩掉洗滌液,重復(fù)3 次,將板內(nèi)殘留洗滌液在吸水紙上甩干。
1.4.2 競(jìng)爭(zhēng) 試劑盒中的抗體按1∶1000 倍稀釋。加樣時(shí)在板上按1 到3 的順序加入標(biāo)樣,每孔100uL ,重復(fù)兩次,其它孔加入待測(cè)樣品,每孔100uL 抗體,注意加入抗體時(shí)不要讓槍頭沾染孔里的樣品與標(biāo)準(zhǔn)樣,然后將酶標(biāo)板放入濕盒里,在37攝氏度下競(jìng)爭(zhēng)30min。
1.4.3 加二抗 試劑盒中的二抗標(biāo)記酶按1 :1000 稀釋。在酶聯(lián)板上每孔加200μL 配制好的二抗標(biāo)記酶,將其放入濕盒,置37攝氏度、30min。
1.4.4 加底物顯色 取底物A、底物B 按等體積混勻,在酶標(biāo)板上每孔加200μL 配好的底物顯色板顯色,顯色后每孔加入50uL 的終止液終止反應(yīng)。在酶標(biāo)儀上測(cè)定各標(biāo)準(zhǔn)樣和各樣品450nm 處的光密度(OD)值,用瘦肉精標(biāo)準(zhǔn)液200ng/mL 孔作為0孔。
2 討論
2.1 試劑盒的貯存
試劑盒在4攝氏度貯存?？贵w和酶標(biāo)二抗(IGg-HRP)在常溫下容易變性,須冷凍保存,使用時(shí)直接拿出按比例稀釋。
2.2 加樣
實(shí)驗(yàn)中有3 次加樣步驟,即加標(biāo)本、酶結(jié)合物和底物。加樣時(shí)應(yīng)將所加物用微量加樣器加在ELISA板孔的底部,可用左手扶住微量加樣器的中部,避免加在孔壁上部,并防止濺出和產(chǎn)生氣泡,導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)誤差。加酶結(jié)合物應(yīng)用液和底物應(yīng)用液時(shí)可用定量多道加液器,使加液過程迅速完成。
2.3 保溫
在實(shí)驗(yàn)中有兩次抗原抗體反應(yīng),即加標(biāo)本和加酶結(jié)合物后?？乖贵w反應(yīng)的完成需要有一定的溫度和時(shí)間,這一保溫過程稱為溫育(incubation)或孵育。因?yàn)镋LISA 屬固相免疫測(cè)定,抗原、抗體的結(jié)合只在固相表面上發(fā)生,加入板孔中的標(biāo)本,其中的抗原并不是都有均等的和固相抗結(jié)合的機(jī)會(huì),只有最貼近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體接觸。這是一個(gè)逐步平衡的過程,因此需經(jīng)擴(kuò)散才能達(dá)到反應(yīng)的終點(diǎn)。在其后加入的酶標(biāo)記抗體與固相抗原的結(jié)合也同樣如此。溫育的溫度通常是37攝氏度,也是大多數(shù)抗原抗體結(jié)合的合適溫度。兩次抗原抗體反應(yīng)一般在37攝氏度經(jīng)1～2h ,產(chǎn)物的生成可達(dá)頂峰。為加速反應(yīng),可提高反應(yīng)的溫度,但最高不要超過43攝氏度。保溫的方式采用水浴,將板置于不銹鋼電熱恒溫水浴鍋中,注意可將ELISA 板置于水浴箱中,ELISA 板底應(yīng)貼著水面,使溫度迅速平衡。為避免蒸發(fā),板一次不宜多于兩塊板同時(shí)測(cè)定。
2.4 洗滌
洗滌在ELISA 法過程中是很關(guān)鍵的一步。ELISA 就是靠洗滌來達(dá)到分離游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的。通過洗滌以清除殘留在板孔中沒能與固相抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì),以及在反應(yīng)過程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。聚苯乙烯等塑料對(duì)蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的,而在洗滌時(shí)又應(yīng)把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來。如果洗板被污染或洗滌用水被游離的酶標(biāo)記物污染、洗滌次數(shù)不夠或注水量不足、洗板后間隔時(shí)間太久致使板孔干燥等都會(huì)直接影響檢測(cè)的最終結(jié)果,嚴(yán)重者實(shí)驗(yàn)不產(chǎn)生顏色致使實(shí)驗(yàn)失敗。
2.5 顯色和比色
顯色是ELISA 中的最后一步溫育反應(yīng),此時(shí)酶催化無色的底物生成有色的產(chǎn)物。反應(yīng)的溫度和時(shí)間仍是影響顯色的因素。在一定時(shí)間內(nèi),陰性孔可保持無色,而陽性孔則隨時(shí)間的延長(zhǎng)而呈色加強(qiáng)。適當(dāng)提高溫度有助于加速顯色進(jìn)行。在定量測(cè)定中,加入底物后的反應(yīng)溫度和時(shí)間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確。酸性終止液H2SO4 會(huì)使藍(lán)色轉(zhuǎn)變成黃色,此時(shí)可用特定的波長(zhǎng)(450nm)測(cè)讀吸光值。比色前應(yīng)先用潔凈的吸水紙拭干板底附著的液體,然后將板正確放入酶標(biāo)比色儀的比色架中。以軟板為載體的試驗(yàn),需先將板置于標(biāo)準(zhǔn)96 孔的座架中,才可進(jìn)行比色。并在加底物液顯色前將軟板邊緣剪凈,以使軟板完全平妥坐入座架中。比色時(shí)應(yīng)以200ng/mL 校零點(diǎn),且孔在邊緣。然后依次測(cè)量不同濃度下的OD 值。
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