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分光光度計(jì)的簡單描述
2013-08-19
二分光光度計(jì)的簡單原理
分光光度計(jì)采用一個(gè)可以產(chǎn)生多個(gè)波長的光源，通過系列分光裝置，從而產(chǎn)生特定波長的光源，光源透過測試的樣品后，部分光源被吸收，計(jì)算樣品的吸光值，從而轉(zhuǎn)化成樣品的濃度。樣品的吸光值與樣品的濃度成正比。
核酸的定量
核酸的定量是分光光度計(jì)使用頻率最高的功能?？梢远咳苡诰彌_液的寡核苷酸，單鏈、雙鏈DNA，以及RNA。核酸的最高吸收峰的吸收波長260 nm。 每種核酸的分子構(gòu)成不一，因此其換算系數(shù)不同。定量不同類型的核酸，事先要選擇對(duì)應(yīng)的系數(shù)。如：1OD的吸光值分別相當(dāng)于50μg/ml的dsDNA，37μg/ml的ssDNA，40μg/ml的RNA，30μg/ml的Olig。測試后的吸光值經(jīng)過上述系數(shù)的換算，從而得出相應(yīng)的樣品濃度。測試前，選擇正確的程序，輸入原液和稀釋液的體積，爾后測試空白液和樣品液。然而，實(shí)驗(yàn)并非一帆風(fēng)順。讀數(shù)不穩(wěn)定可能是實(shí)驗(yàn)者最頭痛的問題。靈敏度越高的儀器，表現(xiàn)出的吸光值漂移越大。
事實(shí)上，分光光度計(jì)的設(shè)計(jì)原理和工作原理，允許吸光值在一定范圍內(nèi)變化，即儀器有一定的準(zhǔn)確度和精確度。如EppendorfBiophotometer的準(zhǔn)確度≤1.0%（1A）。這樣多次測試的結(jié)果在均值1.0%左右之間變動(dòng)，都是正常的。另外，還需考慮核酸本身物化性質(zhì)和溶解核酸的緩沖液的pH值，離子濃度等：在測試時(shí)，離子濃度太高，也會(huì)導(dǎo)致讀數(shù)漂移，因此建議使用pH值一定、離子濃度較低的緩沖液，如TE，可大大穩(wěn)定讀數(shù)。樣品的稀釋濃度同樣是不可忽視的因素：由于樣品中不可避免存在一些細(xì)小的顆粒，尤其是核酸樣品。這些小顆粒的存在干擾測試效果。為了最大程度減少顆粒對(duì)測試結(jié)果的影響，要求核酸吸光值至少大于0.1A，吸光值最好在0.1-1.5A。在此范圍內(nèi)，顆粒的干擾相對(duì)較小，結(jié)果穩(wěn)定。
從而意味著樣品的濃度不能過低，或者過高（超過光度計(jì)的測試范圍）。最后是操作因素，如混合要充分，否則吸光值太低，甚至出現(xiàn)負(fù)值；混合液不能存在氣泡，空白液無懸浮物，否則讀數(shù)漂移劇烈；必須使用相同的比色杯測試空白液和樣品，否則濃度差異太大；換算系數(shù)和樣品濃度單位選擇一致；不能采用窗口磨損的比色杯；樣品的體積必須達(dá)到比色杯要求的最小體積等多個(gè)操作事項(xiàng)。
除了核酸濃度，分光光度計(jì)同時(shí)顯示幾個(gè)非常重要的比值表示樣品的純度，如 A 260 / A 280的比值，用于評(píng)估樣品的純度，因?yàn)榈鞍椎奈辗迨?280 nm。純凈的樣品，比值大于 1.8（DNA）或者2.0（RNA）。如果比值低于 1.8 或者2.0，表示存在蛋白質(zhì)或者酚類物質(zhì)的影響。A 230表示樣品中存在一些污染物，如碳水化合物，多肽，苯酚等，較純凈的核酸 A 260 / A 230 的比值大于 2.0。A 320檢測溶液的混濁度和其他干擾因子。純樣品，A 320 一般是 0。
蛋白質(zhì)的直接定量（UV法）
這種方法是在280 nm波長，直接測試蛋白。選擇 Warburg公式，光度計(jì)可以直接顯示出樣品的濃度，或者是選擇相應(yīng)的換算方法，將吸光值轉(zhuǎn)換為樣品濃度。
蛋白質(zhì)測定過程非常簡單，先測試空白液，然后直接測試蛋白質(zhì)。由于緩沖液中存在一些雜質(zhì)，一般要消除320 nm的“背景”信息，設(shè)定此功能“開”。與測試核酸類似，要求 A 280 的吸光值至少大于 0.1A，最佳的線性范圍在1.0-1.5 之間。實(shí)驗(yàn)中選擇 Warburg 公式顯示樣品濃度時(shí)，發(fā)現(xiàn)讀數(shù)“漂移”。這是一個(gè)正常的現(xiàn)象。事實(shí)上，只要觀察A 280的吸光值的變化范圍不超過 1%，表明結(jié)果非常穩(wěn)定。
漂移的原因是因?yàn)?Warburg公式吸光值換算成濃度，乘以一定的系數(shù)，只要吸光值有少許改變，濃度就會(huì)被放大，從而顯得結(jié)果很不穩(wěn)定。
蛋白質(zhì)直接定量方法，適合測試較純凈、成分相對(duì)單一的蛋白質(zhì)。紫外直接定量法相對(duì)于比色法來說，速度快，操作簡單；但是容易受到平行物質(zhì)的干擾，如DNA 的干擾；另外敏感度低，要求蛋白的濃度較高。
分光光度計(jì)采用一個(gè)可以產(chǎn)生多個(gè)波長的光源，通過系列分光裝置，從而產(chǎn)生特定波長的光源，光源透過測試的樣品后，部分光源被吸收，計(jì)算樣品的吸光值，從而轉(zhuǎn)化成樣品的濃度。樣品的吸光值與樣品的濃度成正比。
核酸的定量
核酸的定量是分光光度計(jì)使用頻率最高的功能?？梢远咳苡诰彌_液的寡核苷酸，單鏈、雙鏈DNA，以及RNA。核酸的最高吸收峰的吸收波長260 nm。 每種核酸的分子構(gòu)成不一，因此其換算系數(shù)不同。定量不同類型的核酸，事先要選擇對(duì)應(yīng)的系數(shù)。如：1OD的吸光值分別相當(dāng)于50μg/ml的dsDNA，37μg/ml的ssDNA，40μg/ml的RNA，30μg/ml的Olig。測試后的吸光值經(jīng)過上述系數(shù)的換算，從而得出相應(yīng)的樣品濃度。測試前，選擇正確的程序，輸入原液和稀釋液的體積，爾后測試空白液和樣品液。然而，實(shí)驗(yàn)并非一帆風(fēng)順。讀數(shù)不穩(wěn)定可能是實(shí)驗(yàn)者最頭痛的問題。靈敏度越高的儀器，表現(xiàn)出的吸光值漂移越大。
事實(shí)上，分光光度計(jì)的設(shè)計(jì)原理和工作原理，允許吸光值在一定范圍內(nèi)變化，即儀器有一定的準(zhǔn)確度和精確度。如EppendorfBiophotometer的準(zhǔn)確度≤1.0%（1A）。這樣多次測試的結(jié)果在均值1.0%左右之間變動(dòng)，都是正常的。另外，還需考慮核酸本身物化性質(zhì)和溶解核酸的緩沖液的pH值，離子濃度等：在測試時(shí)，離子濃度太高，也會(huì)導(dǎo)致讀數(shù)漂移，因此建議使用pH值一定、離子濃度較低的緩沖液，如TE，可大大穩(wěn)定讀數(shù)。樣品的稀釋濃度同樣是不可忽視的因素：由于樣品中不可避免存在一些細(xì)小的顆粒，尤其是核酸樣品。這些小顆粒的存在干擾測試效果。為了最大程度減少顆粒對(duì)測試結(jié)果的影響，要求核酸吸光值至少大于0.1A，吸光值最好在0.1-1.5A。在此范圍內(nèi)，顆粒的干擾相對(duì)較小，結(jié)果穩(wěn)定。
從而意味著樣品的濃度不能過低，或者過高（超過光度計(jì)的測試范圍）。最后是操作因素，如混合要充分，否則吸光值太低，甚至出現(xiàn)負(fù)值；混合液不能存在氣泡，空白液無懸浮物，否則讀數(shù)漂移劇烈；必須使用相同的比色杯測試空白液和樣品，否則濃度差異太大；換算系數(shù)和樣品濃度單位選擇一致；不能采用窗口磨損的比色杯；樣品的體積必須達(dá)到比色杯要求的最小體積等多個(gè)操作事項(xiàng)。
除了核酸濃度，分光光度計(jì)同時(shí)顯示幾個(gè)非常重要的比值表示樣品的純度，如 A 260 / A 280的比值，用于評(píng)估樣品的純度，因?yàn)榈鞍椎奈辗迨?280 nm。純凈的樣品，比值大于 1.8（DNA）或者2.0（RNA）。如果比值低于 1.8 或者2.0，表示存在蛋白質(zhì)或者酚類物質(zhì)的影響。A 230表示樣品中存在一些污染物，如碳水化合物，多肽，苯酚等，較純凈的核酸 A 260 / A 230 的比值大于 2.0。A 320檢測溶液的混濁度和其他干擾因子。純樣品，A 320 一般是 0。
蛋白質(zhì)的直接定量（UV法）
這種方法是在280 nm波長，直接測試蛋白。選擇 Warburg公式，光度計(jì)可以直接顯示出樣品的濃度，或者是選擇相應(yīng)的換算方法，將吸光值轉(zhuǎn)換為樣品濃度。
蛋白質(zhì)測定過程非常簡單，先測試空白液，然后直接測試蛋白質(zhì)。由于緩沖液中存在一些雜質(zhì)，一般要消除320 nm的“背景”信息，設(shè)定此功能“開”。與測試核酸類似，要求 A 280 的吸光值至少大于 0.1A，最佳的線性范圍在1.0-1.5 之間。實(shí)驗(yàn)中選擇 Warburg 公式顯示樣品濃度時(shí)，發(fā)現(xiàn)讀數(shù)“漂移”。這是一個(gè)正常的現(xiàn)象。事實(shí)上，只要觀察A 280的吸光值的變化范圍不超過 1%，表明結(jié)果非常穩(wěn)定。
漂移的原因是因?yàn)?Warburg公式吸光值換算成濃度，乘以一定的系數(shù)，只要吸光值有少許改變，濃度就會(huì)被放大，從而顯得結(jié)果很不穩(wěn)定。
蛋白質(zhì)直接定量方法，適合測試較純凈、成分相對(duì)單一的蛋白質(zhì)。紫外直接定量法相對(duì)于比色法來說，速度快，操作簡單；但是容易受到平行物質(zhì)的干擾，如DNA 的干擾；另外敏感度低，要求蛋白的濃度較高。
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